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ELISA原理

實驗條件和技術(shù)要點：

酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,簡稱ELISA）與免疫酶測定等名稱所指的內(nèi)容是不相同的，ELISA的內(nèi)容專指固相吸附技術(shù)和免疫酶標(biāo)抗體（或抗原）技術(shù)相結(jié)合的一種方法，它是將抗原或抗體包被在固相支持物（或稱載體上），然后再進行免疫反應(yīng)，形成酶標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物，反應(yīng)完畢，借助底物顯示特異結(jié)合的標(biāo)記抗體（或抗原）上的酶活性，用酶與底物反應(yīng)后生成的有色產(chǎn)物進行光密度測定，達到抗原或抗體定量的目的。

在應(yīng)用ELISA時，首先要清楚下面內(nèi)容：1，是檢測抗體還是抗原？2，檢測的結(jié)果是定性還是定量？3，是否需要檢測特異抗體的類型？4，所用抗體/單克隆抗體的親和力怎樣？

（1）檢測抗原  zui常用于檢測抗原的方法是非競爭性的雙抗體夾心法，其次是競爭法。但競爭法在具體實驗中有些困難，特別是檢測微生物的抗原，因為需要標(biāo)記抗原，這對于某些抗原是很難做到的，甚至是不可能的。另外在競爭法中，酶標(biāo)記的抗原與標(biāo)本直接混合在一起，許多標(biāo)本中含有酶抑制劑或蛋白A樣物質(zhì)，可影響ELISA的結(jié)果。

（2）檢測抗體  檢測抗體種類常用的方法是檢測抗體種類的捕獲法，這個方法常用于檢測特異性IgG、IgA和IgM.。這個方法的*步是捕獲所需要檢測的一個種類的抗體，接下來是檢測捕獲的抗體是否是特異性抗原的抗體。間接ELISA在檢測IgG時比較簡單，但不適用于檢測其他種類的抗體，因為血清中如果有特異IgG存在將與IgM或IgA等競爭結(jié)合抗原。

競爭法檢測抗體有兩種方法：一種是將標(biāo)記的抗體和標(biāo)本同時加入反應(yīng)孔內(nèi)，但標(biāo)記的抗體和標(biāo)本中的抗體必須是結(jié)合抗原的不同決定簇；另一種是先加標(biāo)本，沖洗后再加標(biāo)記的抗體。競爭法檢測抗體比間接法容易判斷結(jié)果，并且比較敏感和特異。不論選擇哪種方法，ELISA都包括6個步驟：1，抗原或抗體吸附于固相；2.加標(biāo)本和試劑；3，孵育和沖洗；4，加酶標(biāo)抗原或抗體；5，加適當(dāng)?shù)牡孜铮?/span>6，檢測和分析結(jié)果。

雖然ELISA法在理論上十分簡單，但每一步都有要注意的事項。不論是新設(shè)計的ELISA還是沿用其他ELISA方法都有以下幾方面技術(shù)要點：固相載體的選擇和試劑的制備，反應(yīng)條件和操作的標(biāo)準(zhǔn)化。酶標(biāo)記抗原競爭法利用混合的未標(biāo)記抗原和酶標(biāo)記抗原相互競爭抗體上的結(jié)合點，從而進行抗原的定量。未標(biāo)記抗原的量越大，則酶標(biāo)記抗原和抗體的結(jié)合就越受到抑制。但是競爭法在實驗時比較復(fù)雜，有時在抗原混合液與相應(yīng)抗體孵育后，在測定游離抗原與抗體相結(jié)合抗原的活性以前，要先進行鹽析或有機溶劑沉淀或第二抗體沉淀等方法把兩種不同存在形態(tài)的抗原分開。并且在加入底物后，容易產(chǎn)生血清色的物質(zhì)。因此，每次測定時都需做空白對照。由于這些缺點，酶標(biāo)記抗原競爭法使用不多。